סרטן שלפוחית השתן – סמן רגיש חדש לאבחון סרטן שלפוחית השתן: MCM5, חלק ב`

פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית,
מרכז רפואי שיבא, תל-השומר; החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה,
אוניברסיטת תל-אביב.

לקריאת חלק א' לחץ כאן

ו. ציטוקרטינים-cytokeratins:
מדובר בסיבי הביניים (intermediate filaments) הבונים את שלד תאי
האפיתל ואת הגידולים, השפירים והממאירים (קרצינומות), הנובעים
מהם. הציטוקרטינים אינם מוגבלים לתאי אפיתל בלבד: מוצאים אותם גם בחלק קטן מהמלנומות
(כ-3-4%) וכן ברקמות תקינות וגידולים מזנכימאליים כגון השריר החלק של קיר הרחם,
השריר החלק של כלי הדם ובתאי אנדותל. 
זוהו עד כה כ-20 ציטוקרטינים שונים המתחלקים לשתי קבוצות: א. הקבוצה החומצית ( type A=acidic),  והקבוצה הבסיסית (type B=basic) הקבוצה החומצית כוללת 12 סוגים של
ציטוקרטינים הממוספרים מציטוקרטין מספר 9 ( CK9) עד ציטוקרטין מספר 20 (CK20) – על פי משקלם המולקולארי מהגבוה לנמוך.

 הציטוקרטינים הבסיסיים ממוספרים
בשיטה דומה מ-CK1 ועד CK8 בהתאם למשקלם המולקולארי מהגבוה (CK1) לנמוך (CK8). בתאים עצמם הציטוקרטינים מסודרים בצורת
סיבים (פילמנטים). אלה בנויים משילוב של קרטין חומצי ובסיסי, לפחות אחד מכל סוג.
בהתאם לעיקרון זה כל תאי האפיתל מכילים שני סוגי ציטוקרטינים שונים לפחות. בתאי
הכבד, לדוגמה, מוצאים שני ציטוקרטינים (CK8 ו-CK18), בעוד הציטוקרטינים הבונים את אפידרמיס
העור בנויים ממערך מורכב של בין 6 ל-10 קרטינים שונים (CK5, CK14, CK1 CK10 ועוד).

הציטוקרטינים מתבטאים בצורה מוגברת בתאים
סרטניים,כאשר  CK8, CK18, CK19
ו-CK20 קשורים לתאי סרטן
שלפוחית השתן. כיום מקדמים בעיקר את בדיקת  CK8 ו-CK18 בשתן בשיטה איכותית ליד מיטת החולה (point of care) שיש להם רגישות של 66% וספציפיות של 90%.
לעומת זאת ל-CK19 יש שיטת מדידה
כמותית בשיטות  ELISA או
בשיטת RIA הרדיואקטיבית. ל-CK19 יש מקטע מסיס הידוע כ- 21-1fragment , שניתן למדוד אותו בשתן או בדם.

ז. גילוי הֶמאטוּריה:
מצב של הופעת כדוריות דם אדומות בשתן נמצא לעתים קרובות בדגימות שתן של חולים עם
סרטן השלפוחית. המאטוריה יכולה להיות תרחיש המעיד על שלב מוקדם של קרצינומה של
המערכת האורו-גניטאלית. 
יחד עם זאת לשיטה זו ספציפיות נמוכה יחסית של 67%, שכן המאטוריה יכולה להופיע
בנבדקים במצבים של אבני כליות, שגשוש שפיר של בלוטת הערמונית, ובמצבי דלקת של דרכי
השתן.

ח. מולקולת התאחיזה CEACAM1 או Carcinoembryonic antigen related cell
adhesion molecule 1:

חלבון זה (CEACAM1) בא לביטוי בדרך כלל על
פני רקמות נורמאליות של שלפוחית השתן, ודווקא בתאים סרטניים של השלפוחית יש ביטוי
מופחת שלו. יש לו תכונות של מדכא (suppressor) של תאי סרטן, אך נמצא שרמתו מוגברת בשלבים
ממאירים גרורתיים של סרטן השלפוחית.
יש למבדק זה רגישות של 74% וספציפיות של 95%. בהתאם, רמתו בשתן מוגברת אצל מטופלים
עם סרטן השלפוחית בדרגה גבוהה.

ט. חומצה היָאלוּרוֹנית ו-hyaluronidase:
חומצה היאלורונית (hyaluronic acid להלן HA) הוא GAG או gucosaminoglycan, הנמצא בשפע ברקמות נורמאליות ובנוזלים
המקיפים אותן. ל-HA יש
תפקיד בפיקוח על כושר הספיחה של תאי וההתרבות שלהם. 
רמות מוגברת שלHA  מוצאים
בדגימות שתן של מאובחנים עם סרטן השלפוחית. האנזים hyaluronidase הוא אנדו-גליקוזידאזה המבקע HA למקטעים קטנים, ובכך מגביר את תהליך
האנגיוגניות, בו תאים סרטניים מסייעים לתהליך הגרורתי של עצמם על ידי השריית צמיחת
כלי-דם חדשים בסמיכות לגידול הסרטני המקורי, כדי לקבל אספקה עשירה יותר של פקטורי
צמיחה ושגשוג מהדם.

י. Survivin: 
חלבון מרתק אחר בהקשר של אבחון סרטן שלפוחית
השתן הוא survivin,
שהוא חלבון נוגד-אפופטוזיס המתבטא רק ברקמה עוברית, אך לא מצוי בתאים בוגרים שעברו
תהליך התמיינות (differentiation). 
אפופטוזיס או מוות תאי מתוכנת, הוא מנגנון הוֹמֵאוֹסטטי המביא למותם המתוכנת של תאים
ברקמות תקינות וממאירות כאחד, ומו֭וסת על-ידי שני גורמים מנוגדים: מחד-גיסא, משפחת
אנזימי caspase שהם
ציסטאין-פרוטאינזות המסייעות לתהליך מות התאים המתוכנת, ומאידך-גיסא, שלוש משפחות
חלבונים המעכבות את התהליך: bcl2, חלבוני heat shock  (בעיקר HSP-70 ו-HSP-27), וכן משפחת חלבונים מעכבי מות תאים מתוכנת
הידועים כ-AIP (apoptosis inhibitory proteins). 

כל אלה עשויים למנוע מות תאים מתוכנת,
ובכך להביא לשגשוג של תאים ממאירים ואף לגרום לעמידותם בפני תרופות
ציטוסטטיות. 
חלבוני IAP השתמרו מבחינה התפתחותית
מהנגיפים ועד ליונקים. הם מכילים 2-3 רצפים חוזרים העשירים ב- cysteine/histidine, מכונים BIR (baculovirus repeats IAP) שכן מוצאים כמותם גם
בנגיפי baculo. כמו-כן, מכילים
חלבונים אלה שייר קצה קרבוקסילי הידוע כ- RING finger. 

משפחת IAP מכילה 5 חלבונים, והאחרון בהם, שהתגלה
בשנת 1997 הוא survivin,
חלבון ציטופלסמי בעל משקל מולקולארי של 16,500 דלטון.
ייחודו של survivin הוא
בעובדה שהוא מכיל BIR יחיד
בלבד, והוא חסר את ה-RING finger,
אולם בהבדל מחלבוני משפחת IAP האחרים,
הוא מתבטא ברקמה עוברית, אך אינו מצוי בתאים בוגרים שעברו התמיינות. כמו-כן, הוא
מתבטא באופן בררני בכל התאים הממאירים שנבחנו עד כה בבני-אדם.

מאז הפרסום הראשון בשנת 1997, מעורר survivin עניין רב, הן בשל פעילותו במניעת מות
תאים מתוכנת והן בנוכחות הסגולית שלו בתאים ממאירים בלבד.
ההשערה שחלבון זה יכול לשמש כסמן לממאירויות ואולי אף כמדד פרוגנוסטי להערכת דרגת
השאת וחומרתה, הובילה לביצוע מחקרים רבים בסוגי סרטן מגוונים. אכן, רמות survivin בשתן נמצאו מוגברות במטופלים עם סרטן
השלפוחית. לבדיקה יש רגישות של 64-94% וספציפיות של 93-100%, אם כי בגידולי שלפוחית
בדרגה גבוהה הרגישות של הבדיקה היא של 83% ואילו בגידולים בדרגה נמוכה רגישותו היא
רק של 35%.  

יא. מוטציות ב-FGFR: 
החלבון FGFR3 או fibroblast growth factor receptor 3, שייך למשפחת קולטני
טירוזין קינאזה. מוטציות בחלבון זה מתרחשות כמעט ב-50% מסרטני שלפוחית השתן ובעיקר
ניתן למצוא אותן בגידולי שלפוחית שטחיים בדרגה נמוכה. 
ניתן למצוא ביטוי של FGFR בתאים
נורמאליים כמו גם בתאי סרטן, אך מוטציות בחלבון זה מופיעות רק ברקמה סרטנית. המוטציהS249C  בה יש שינוי נוקלאוטידי ב-DNA מ-TCC ל-TGC, היא המוטציה השכיחה ביותר בסרטני השלפוחית,
וגילוי מוטציה זו בתאי סרטן המופרשים בשתן היא בעלת רגישות של 62% שהיא מתונה
יחסית, אך רגישות הגילוי מוטציה זו בכל הקשור להישָנוּת (recurrence) של סרטן השלפוחית המוערכת ב-58%, גבוהה
מהרגישות של השיטות הציטולוגיות בהערכה של הופעה חוזרת של גידול זה. 

רמות לא מרשימות במיוחד של רגישות וסגוליות
של כל 11 הסמנים המוזכרים, בנוסף לעלות המשמעותית של רובם, מגבילה את הכנסתם של
סמנים אלה לשגרה הקלינית, ואף עודדה שימוש בשיטות פּרוֹטאוֹמיוֹת (proteomics) לגילוי וזיהוי של סרטן שלפוחית השתן, אלא
שגם טכנולוגיה זו עדיין אינה נחלתן של רבות מהמעבדות הקליניות (Gaston ו-Grossman ב-Methods Mol Biol משנת 2010).

הסמן MCM5:
תהליך אתחול הרפליקציה של DNA
מייצג את השלב הסופי והקריטי בבקרה של חלוקת ושגשוג תאים סרטניים, ולכן הוא עשוי
לשמש יעד אבחוני ותרפויטי בפגיעה בתאים סרטניים (Williams ו-Stoeber ב-Curr Opin Cell Biol משנת 2007). חלבונים השייכים למשפחת ה-mini-chromosome maintenance או MCM, על ששת חבריה MCM2) עד (MCM7.
כל אחד מחלבוני MCM
יכול להתכנס לתוך קומפלקסים הֶקסָמֶריים בעלי פעילות של DNA helicase, החיונית לאתחול סינתזת DNA (על פי Machida וחב' ב-Cell משנת 2005, ו-Remus ו-Diffley ב-Curr Opin Cell Biol משנת 2009).
במערכות אפיתליאליות, עוברים חלבוני MCM דיס-רגולציה, והם מתבטאים באופן מופרז
במצבים ממאירים אך גם בנגעים דיספלסטיים קדם-סרטניים (Williams וחב' ב- Proc Natl Acad Sci USAמשנת 1998, ו-Going וחב' ב-Gut משנת 2002). ניתן לסכם שתאים מתחלקים מבטאים
את MCM5 ברמה גבוהה, ואילו תאים
שאינם מתחלקים בדרגת התמיינות (differentiation) גבוהה, או תאים מזדקנים (senescent) אינם מבטאים MCM5. 

אכן, דרגת הביטוי של MCM2 ו-MCM5 נמצאה מנבאת את ההישנוּת ואת התמותה במטופלים
עם סרטן שלפוחית השתן (Burger
וחב' ב-Br J
Cancer
משנת 2007, ו-Korkolopoulou
וחב' ב-Hum
Pathol
משנת 2005, ו-Kruger
וחב' ב-Eur Eurol משנת 2003).
הביטוי של חלבוני MCM2-7
באפיתל הנורמאלי, מוגבל לתאים באזורים הבזאליים אך הוא אינו מתבטא בשכבות שטח
הפנים כאשר תאים אלה כבר מייצגים פנוטיפ שעבר התמיינות מלאה. בנגעים
דיספלסטיים/קדם סרטניים בשכבות שטחיות, יש ביטוי של חלבוני MCM, לכן הגילוי של תאי שלפוחית מתקלפים
המופיעים בשתן, ומכילים MCM,
עשוי לספק שיטה רגישה לגילוי תאי סרטן חודרניים או בלתי חודרניים (Eward וחב' ב-J Cell Sci משנת 2004, ו-Barkley וחב' ב-Exp Cell Res משנת 2007).
ב-urothelium נורמאלי, הביטוי של MCM5 מוגבל לשכבה הבזאלית, ולעומת זאת, במצבים של
קרצינומה לא-חודרנית וחודרנית ב-urothelium הביטוי של MCM5 מתקיים בכל השכבות של ה-urothelium כולל שכבת האפיתל השטחית. לכן תאים המתקלפים
לתוך השתן, של תאים סרטניים המכילים MCM5 ניתנים לגילוי יעיל.

אכן, באחד המחקרים החלוציים בנושא זה, הראו
Stoeber וחב' בשנת 2002 ב-J Natl Cancer Inst רמות מוגברות של  MCM5 בתאים שבודדו ממשקעים בשתן של נבדקים עם
סרטן השלפוחית. במחקר זה נעשה שימוש בשיטה אימונו-פלואורומטרית לגילוי MCM5 בדרגת רגישות של 92% וסגוליות של 78%.
הגן המקודד MCM5 ממוקם על כרומוזום 22
בעמדה 22q13.3 על פי Tsuruga וחב' ב-Biochim Biophys Res Commun משנת 1997. גן זה מכיל 16
אֶקסוֹנים.

בשנת 2012 התפרסם ב-PLos One מחקר מקיף של Kelly וחב', שהיה מחקר רב-מוסדי שהתקיים ב-9
מחלקות אורולוגיות ומחלקות אונקולוגיות במרכזים רפואיים בלונדון, קיימברידג'
וגלזגו.
מטרת המחקר הייתה להעריך ולהשוות את יכולת האבחון והזיהוי של סרטן שלפוחית השתן,
בין MCM5 לבין NMP22. למחקר גויסו 1,677 מטופלים שנמצאו במעקב
לאפשרות של ממאירות בדרכי השתן, במחקר תצפיתי פרוספקטיבי, כפול סמיות, כל משתתפי
המחקר עברו בדיקת על-שמע, אוּרוֹגרפיה תוך ורידית (IVU), ציסטוסקופיה, תרבית שתן ואנליזה
ציטולוגית. במחקר זה נוסתה גישה אימונו-פלואורומטרית למדידת MCM5, ושימוש בערכה המאושרת על ידי ה-FDA למדידת NMP22. 

תוצאות מחקר זה היו כדלקמן: ממאירויות אורו-גניטליות זוהו ב-210 מתוך
1,564 נבדקים (13%) עם תוצאת MCM5
חיובית, וב-195 מתוך 1,396 נבדקים (14%) עם תוצאת NMP22 חיובית. ברף cut-point בו רגישות וסגוליות הבדיקה היו זהות, מבחן MCM5 זיהה סרטנים ראשוניים ונשנים של שלפוחית
השתן ברגישות של 69%, ועם ערך ניבוי שלילי ((NPV של 93%.
השטח מתחת עקומת ROC
עבור מבדק MCM5 נקבע כ-75%, בעוד שעבור
מבדק NMP22 נקבע שטח מתחת לעקומת ROC של 72%. חשוב לציין שמבדק משולב של MCM5 ו-NMP22, זיהה עם רגישות של 95% מהמקרים המהווים
באופן פוטנציאלי סכנת חיים (grade 3 או (stage ≥pT1, וכן עם סגוליות של 95%.

ערכת ADXBLADDER של חברת Arquer לזיהוי סמן MCM5:
השיטה האימונו-פלואורומטרית מורכבת ולא
זמינה לביצוע ברוב המעבדות הקליניות. חברת Arquer Diagnostics הבריטית שמרכזה בסנדרלנד, פיתחה את ערכת
"MCM5
ELISA",
המייצגת שיפור משמעותי בכימות של MCM5. מדובר בשיטת ELISA, ודגימות שתן הושגו מ-510 מטופלים, בהם
אובחנה המטוריה או UTI,
ואשר הגיעו לטיפול בשלושה מבתי החולים המובילים בבריטניה.
כל הנבדקים עברו בדיקה ציסטוסקופית לאחר מתן דגימת שתן בנפח של 30 מ"ל. לאחר
סרכוז במהירות 1,500g למשך 5 דקות, הורחקה
תמיסת השתן העליונה, והמשקע הוּרחף מחדש ב-0.3 מ"ל של בופר lysis. ה-lysate הוקפא בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות.
לאחר ביצוע מבחן ה-ELISA
הסטנדרטי בפלטת 96 בארות, הושוו התוצאות לבדיקת הציסטוסקופיה בדיקות ההדמיה
והביופסיה. מתוך 510 הנבדקים שגויסו נפלטו מהניסוי 164 נבדקים (ב-36 מתוכם הסיבה
לממצאים הפתולוגיים היו אבנים בכליות ובדרכי השתן, ב-23 אובחן סרטן הערמונית, ב-5
אובחן סרטן הכליה, וב-100 מתוכם לא התקבלו תוצאות של בדיקות אחרות או הסכמת
הנבדקים להשתתפות במחקר. מתוך 346 נבדקים ראויים, 317 נמצאו שליליים לסרטן בלוטת
השתן, וב-29 מתוכם אובחן סרטן זה.

מבדק זה נתן את התוצאות הבאות: ב-24 מתוך 29 מקרי סרטן השלפוחית המוכחים
התקבלה תוצאת MCM5 ELISA
חיובית, ורק ב-5 מתוכם תוצאת MCM5 ELISA התקבלה שלילית, דהיינו רגישות הבדיקה-83%.
מתוך 317 נבדקים שנמצאו שליליים לסרטן שלפוחית השתן, ב-73 נמצאה תוצאתMCM5  חיובית ואילו ב-244 מתוכם תוצאת MCM5 התקבלה שלילית, דהיינו סגוליות הבדיקה נקבעה
כ-77%. בסך הכול, מתוך 249 נבדקים בהם התקבל אבחון שלילי של סרטן שלפוחית השתן,
ב-244 מתוכם התקבלה תוצאת MCM5,
דהיינו לבדיקה זו יש ערך ניבוי שלילי (NPV) של 244/249 או 98%.

השוואה של מבחני ELISA של הסמן MCM5 לעומת 
:MP22
100 דגימות נבחנו במקביל על ידי מבחני ELISA של הסמנים MCM5 ו-NMP22. בתת-קבוצה זו של נבדקים נמצאה לגבי הסמן NMP22 רגישות של 53.3% (16/30), בעוד ששימוש בסמן MCM5 הראה רגישות של 86.7% (26/30).
בכל 16 הנבדקים בהם התקבלה תוצאה חיובית במבחן NMP22, התקבלה תוצאה חיובית גם עם MCM5. בניסוי זה נבדק המתאם בין תוצאות הבחינה
הציטולוגית לבין תוצאות בדיקת ה-ELISA של MCM5. 98 דגימות שתן נבדקו לגבי 2 הפרמטרים
האמורים, והתוצאות כדלקמן: במדגם זה נמצאו 10 מקרים מוכחים של סרטן שלפוחית השתן,
כאשר רק ב-4 מהמקרים הללו התקבלה תוצאה חיובית בבדיקה הציטולוגית (רגישות של 40%)
לעומת 8 מהמקרים הללו בהם התקבלה תוצאה חיובית במבחן MCM5 (רגישות של 80%).
מבחנים אלה הדגימו את יתרונות הרגישות של מדידת MCM5 בשיטת ה-ELISA על פני מדד NMP22 כמו גם על פני הבדיקה הציטולוגית, וכן בערך
הניבוי השלילי (negative predictive value)
הגבוה.

הכנסת סמן חדש ורגיש דוגמת MCM5 לארסנל הבדיקות האבחוניות לזיהוי סרטן
שלפוחית השתן, היא ודאי בשורה טובה לאורולוגים שאבחון ממאירות זו היא לחם חוקם
יום-יום, ועוד יותר מכך לאלה שמחלה זו פוקדת אותם. 

בברכה, פרופ' בן-עמי סלע.