גישה מהפכנית של ממש: בדיקת הדם העתידית שתסייע לזהות 8 סוגי סרטן בראשיתם! חלק ב`.

פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית  וביוכימיה, פקולטה
לרפואה,  אוניברסיטת תל-אביב.

לקריאת חלק א'
לחץ כאן  

ctDNA כסמן פרוגנוסטי:
השימוש ב-ctDNA כסמן פרוגנוסטי, תואר
בזמנו בגידולים באגן, במעי הגס, בלבלב וכן במלנומה (Rapisuwon וחב' ב-CoputStruct Biotechnology Journal ofמשנת 2016). לדוגמה, במחקר על מוטציות KRAS והיפר-מתילציה של CDKN2A בחולי סרטן המעי הגס, נמצא שיעור של 100% הישרדות לתקופת שנתיים
בנבדקים עם רמות ctDNA הנמוכות מסף הגילוי (Lecomte וחב' ב-International  Journal of Cancer משנת 2002).
ממצאים דומים התגלו לגבי נבדקים עם סרטן המעי הגס בהם רמות ctDNA היו ניתנות לגילוי, בהם נשנתה המחלה תוך
שנה. ממצא זה מרמז לערך הפרוגנוסטי של רמת ctDNA בסרטן המעי הגס (Diehl וחב' ב-Nature Medicine משנת 2008).

אחת מהאינדיקציות הפרוגנוסטיות היותר אמינות היא בהערכה של דרגת המחלה
(Crowley וחב' ב-Clinical Oncology משנת 2013). באופן כללי, גידולים סרטניים
בדרגה נמוכה, כרוכים בפרוגנוזה טובה יותר.
למרות שמספר מחקרים הראו שלרמות גבוהות יותר של ctDNA יש נטייה להיות כרוכות בשלב מחלה גרורתי, רמת ctDNA אינה כרוכה תמיד בדרגת החומרה של הגידול (Bratman וחב' ב-Expert Review in Molecular Diagnosis משנת 2015). מסיבה זו, אין זה סביר ש-ctDNA יחליף את השיטות המקובלות לריבוד (stratification) המטופלים, תוך התבססות על מחלה יותר
אגרסיבית או פחות אגרסיבית.

השיטות המקובלות לאשש את דרגת ואת שלב המחלה, הן multi-factorial, וכוללות נתונים המבוססים על אנליזה
היסטולוגית, אימונו-היסטוכימית ומולקולארית. בנוסף, במקרה של סרטן שד וסרטן המעי
הגס, ישנם מבחנים המאושרים על ידי ה-FDA להבדיל בין מצבי סרטניים בסיכון גבוה או בסיכון נמוך, וזאת על ידי
בחינה של ביופסיות שמקורן בגידול (Maak וחב' ב-Annals in Surgery משנת 2013, ו-Van't Veer וחב' ב-Nature משנת 2002, ו-Paik וחב' ב-New England Journal
of Medicine משנת 2004 ו-Nygaard וחב' ב-Lung Cancer משנת 2013). אמנם, אין סבירות גבוהה ש-ctDNA יוכל לשמש כמנבא פרוגנוסטי יחיד, אך יוכל לסייע במקרים בהם אין
אפשרות להפיק ביופסיה, או שבהם חומר מהגידול אינו מתאים לאנליזה גנטית.

הופעתם של גידולים סרטניים עמידים לתרופות בגלל הטרוגניות של תאים
בתוך הגידול היא תופעה קריטית ליעילות הטיפול. שבט (clone) גנטי קטן בתוך הגידול יכול להתרחב בממדיו לאחר טיפול תרופתי אם
הוא נושא מוטציה המקנה לו עמידות לטיפול תרופתי זה. ביופסיות התחלתיות עלולות
להחמיץ את הקלונים הללו או כיוון ששכיחותם נמוכה או כיוון שמיקומם המרחבי בתוך
הגידול החמיץ את הכללתם בביופסיה.
לדוגמה, כיוון שביופסיה דוגמת רק חלק קטן של הגידול, קלונים חריגים הממוקמים
באזורי גידול אחרים אינם נכללים בביופסיה ואינם מובחנים. נתון זה עלול להטעות מחקר
על תפקיד ההטרוגניות של הגידול בהתקדמות המחלה או בהישנותה. השילוב של ctDNA במחקר עשוי למנוע את המגבלות האחרונות כיוון
שהוא עשוי לספק תמונת מצב המשקפת יותר את השונות הגנטית של התהליך הסרטני הן
בגידול הראשוני כמו גם בחלקיו הגרורתיים. לדוגמה, נמצא ש-ctDNA מועיל בחקר האבולציה של קלונים חריגים אלה בגידול הסרטני לפני וגם
אחרי מתן הטיפול התרופתי (Murtaza וחב' ב-Nature Communication משנת 2015).

זיהוי של DNA "נורמאלי"
בהשוואה ל-DNA סרטני
שיקול חשוב בשימוש ב-ctDNA כסמן סרטני הוא ביכולתו להבדיל בין cfDNA של תאים בריאים לזה של תאים סרטניים.
cfDNA מופרש על ידי תאים לא-ממאירים במהלך turnover תאי נורמאלי, אך לא במהלך פרוצדורות כמו ניתוחים,
כימותרפיה ורדיו-תרפיה. יש סברה שלימפוציטים הם התורמים העיקריים ל-cfDNA בנסיוב.
מספר מחקרים הראו שרמות מוגברות של cfDNA נמצאו בחולי סרטן בהשוואה לאנשים בריאים, וכן שבמספר הקשרים רמות cfDNA נמצאות במתאם טוב עם התקדמות המחלה (Perkins וחב' ב-PLos One משנת 2012). בדומה,
גם Koffler וחב' (Journal Clinical Investigation משנת 1973) מצאו מתאם טוב של רמות cfDNA בחולי סרטן בהשוואה לאנשים בריאים. עם זאת,
קשה להחליט את היחס בין DNA ממקור תאי הסרטן, כיוון
שישנם מצבים פיזיולוגיים בהם cfDNA מוגבר, כמו במצבי דלקת או
פציעה.

ctDNA בבדיקות סריקה של סרטן
השימושיות הקלינית של ctDNA בגילוי גידול סרטני ראשוני מוגבלת באופן חלקי בגלל הכמויות הקטנות
של ctDNA
(Pisetsky ו-Fairhurst ב-Autoimmunity משנת 2007). חוקרים ב-John Hopkins העריכו את היכולת לגלות ctDNA על ידי שימוש ב-PCR דיגיטלי ב-640 מטופלים עם סוגי סרטן שונים. ctDNA התגלה רק ב-48-73% מהנבדקים.
חשוב לציין, שבמחקר על ידי Kopreski וחב' ב- Journal National
Cancer Institute משנת 2000, מוטציות ב-KRAS, שהוא אונקוגן בעל מוטציות אחדות בסרטן המעי
הגס, התגלו ברקמת המעי הגס של נבדקים בריאים. למעשה, ב-58% מבין אלה עם מוטציות ב-KRAS לא התגלתה בקולונוסקופיה כל עדות לממאירות,
מה שיכול להביע על תוצאות חיוביות-כזובות עם בחינת ctDNA. עם זאת ייתכן שמדובר בנגעים קדם-ממאירים.

רובם המכריע של גידולים סרטניים נושאים מוטציות סומטיות ב-DNA, בניגוד למוטציות העוברות בתורשה מהורים
לילדיהם ומופיעים בכל תא בגוף, מוטציות סומטיות הנוצרות ב-DNA של תאים אינדיבידואליים במהלך חיי האדם.
כיוון שמוטציות סומטיות אלו מופיעות רק ב-DNA של תאים סרטניים, הן מספקות סמן ספציפי ביותר שניתן להתגלות.
למרות שהגידול הסרטני עצמו הוא מקור עיקרי של DNA סרטני, השגת DNA זה על ידי ביופסיה הוא
הליך חודרני, מסוכן ולעיתים אף בלתי-אפשרי.
אך מחקר גילה שתאים סרטניים מתים, מפרישים פיסות קטנות של ה-DNA שלהם לזרם הדם. פיסות DNA אלו מוגדרות כ-cell-free circulating tumor
DNA או ctDNA. מאמר שהתפרסם בפברואר 2014 ב- Science of Translational
Medicine, הראה של-ctDNA יש פוטנציאל לסייע בגילוי מוטציות סומטיות
כאמצעי למעקב אחר התפתחות הגדול הסרטני.

החוקרים החלו על ידי זיהוי של לפחות מוטציה סומטית אחת בגידולים של
187 מטופלים עם 17 סוגי סרטן שונים בשלבים מתקדמים של המחלה. הם עשו ריצוף של מספר
גנים בהם מופיעות מוטציות לעיתים תכופות, ואם לא נמצאו מוטציות, הם הרחיבו את
הבדיקה וריצפו את כל אזורי הגנום המקודדים לחלבון, או אף את כל הגנום עצמו. ה-ctDNA שנמצא בדמם של הנבדקים, נבחן לנוכחות של
מוטציות סומטיות שזוהו בגידול הסרטני שלהם.
החוקרים היו מסוגלים לזהות את המוטציות הסומטיות ב-ctDNA של 82% מחולי הסרטן עם גידולים גרורתיים מחוץ למוח. לשם השוואה,
55% מהנבדקים עם שלבים מוקדמים של סרטן, הכילו בדמם רמות ניתנות לגילוי של ctDNA. המסקנה מתוך ממצאים אלה הייתה שאחוז
הנבדקים עם רמות ברות-גילוי של ctDNA בדמם, היה במתאם טוב עם
דרגת הגידול.
בעוד ש-47% מהנבדקים עם גידולים ב-stage I הכילו בדם ctDNA בר-גילוי, האחוז של
נבדקים עם מחלה בדרגה III, II או IV, בהם ניתן היה לגלות את ctDNA היה 55%, 69% ו-82%, בהתאמה. יתרה מכך, נמצא
שריכוזי ctDNA בדם, גדלו ביחס ישר לדרגת
הגידול. למעשה, כאשר נמדדו ריכוזי ctDNA בדמם ש 206 חולים בסרטן המעי הגס, ריכוזים נמוכים יותר של ctDNA היו במתאם טוב עם תקופת הישרדות ארוכה יותר. 

השימוש של ctDNA לניטור סרטן
גם אם ctDNA עלול להיות בהווה לא
שימושי באבחון סרטן הוא יכול להיות יעיל בניטור התקדמות המחלה והתגובה לטיפולים,
כאשר אבחנה ש המחלה כבר נעשתה. לגבי רוב הגידולים, שיטות הדמיה כ-CT, PET או MRI נחשבים "סטנדרט זהב" לניטור המחלה. עם זאת, שיטות
ההדמיה יקרות, ואף מוגבלות ביכולת הגילוי שלהן, וקיימת רזולוציה דלה לגבי גידולים
בקוטר הקטן מ-1 ס"מ (Huang וחב' ב-Practical Radiation
Oncology משנת 2013).
ניטור מספר סוגי סרטן נעשה גם על ידי מדידת של סמנים חלבוניים ספציפיים לסוגי סרטן
אלה, כאשר הדוגמה הבולטת ביותר היא PSA המשמש כסמן של סרטן הערמונית. אך סמנים אלה הם לעיתים לא אמינים,
מה גם שלרוב סוגי הסרטן אף אין סמנים ספציפיים (Velonas וחב' ב-International Journal of Molecular Science משנת 2013).
לכן, ctDNA עשוי לספק אמצעי לניטור מסת הגידול למגוון
גדול יותר של סוגי סרטן, כולל סרטן השד (Umetani וחב ב-Journal of Clinical Oncology משנת 2006), סרטן פּריאמפולארי של הלבלב (Umetani וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2006), סרטן המעי הגס, סרטן הראש
והצוואר (Nawroz וחב' ב-Nature Med משנת 1996), מלנומה (Pinzani וחב' ב-Clinica Chimica Acta משנת 2011), סרטן תאי clear בכליה (Gang וחב' ב-Urology משנת 2010), וסרטן
הערמונית (Hanley וחב' ב-Clin Cancer Res משנת 2006).

יתרון נוסף של ctDNA הוא בכך שיש בו הפוטנציאל
לשקף התפתחות הגידול ב"זמן אמת"; נטילת מספר דגימות לפני התחלת הטיפול,
במהלכו ולאחריו, עשויה לתת נתונים על התגובה לטיפול ויעילותו שיש בה להשפיע על
המשך הטיפול.
הסטיות הגנטיות שעלולות להוביל לעמידות לטיפולים אינן אמורות להיות מיוצגות בלקיחת
ביופסיה מהגידול, לפני התחלת הטיפול. לכן, ctDNA מייצג חלופה אטרקטיבית לגילוי של עמידות לטיפול.
לדוגמה, במחקר של Spindler וחב' ב-International Journal
of Cancer משנת 2014, נוטרו
המוטציות KRAS/BRAF בדגימות פלזמה של 108
מטופלים עם סרטן מעי גס מפושט, לפני ואחרי מספר מחזורי טיפול כימותרפי עם cetuximab ו-irinotecan. הריכוז של מוטציות KRAS בדגימות הפלזמה פחת עם מחזורי הטיפול, והעלמות של מוטציות ניתנות
לגילוי היו במתאם טוב עם יעילות הטיפול. חוקרים אלה הבחינו גם בהופעתן של מוטציות
חדשות, שיכולות לשקף עמידות נרכשת לטיפול. מחקר זה סיפק ראיות לכך ש-ctDNA עשוי להיות סמן ביולוגי לניטור ההתפתחות של
סרטן המעי הגס.

עדות למחלה על ידי שיטות הדמיה מסורתיות, כגון CT, PET ו-MRI עלולה להיעלם לאחר הרחקה
ניתוחית של השאת. לכן, אנליזה של ctDNA מבטאת מסלול פוטנציאלי לגילוי של minimal residual disease או MRD, והתלקחות מחודשת של המחלה, באותם מקרים בהם גוש הגידול העיקרי
הורחק, ושיטות ההדמיה הקונבנציונאליות אינן יעילות. השוואה של גילוי MRD על ידי CT או בשיטת ctDNA בוצעה במטופלים בדרגה II של סרטן המעי הגס. מחקר זה על ידי Hanley וקבוצתו, הם הצליחו לגלות ctDNA במטופלים בהם CT נכשל בזיהוי המחלה. עם
זאת, חוקרים אלה מציינים שאנליזה של ctDNA סובלת ממספר מגבלות, וכך דגימות פלזמה שנאספו 36 חודשים לאחר
ניתוח היו מסוגלות לנבא הישנות המחלה רק ב-48% מהמקרים. 

שיטות אנליטיות לגילוי ctDNA
אנליזות לגילוי ctDNA משתרעות בסקאלה שבין
מוטציות בודדות לגנום השלם. גישות מתודולוגיות עכשוויות לגילוי ctDNA, מתחלקות ל-2 סוגים עיקריים:
1. שיטות מכוונות לבחינה של מוטציות hot spot ברגישות גבוהה
2. שיטות שאינן מכוונות המאפשרות ריצוף סימולטני של מיליוני מקטעים של
DNA ללא מידע ריצוף קודם, אך דורשות שכמות ctDNA תהיה בערך 5-10% מכלל פרקציית ה-DNA.

שיטת הריצוף של Sanger לאנליזה של ctDNA בפלזמה פותחה בשנת 1997, ויש לה חסרונות
רבים כגון תפוקה נמוכה, השחתת זמן יקר, עלות גבוהה ואף פוטנציאל לזיהוי מוטעה (Vendrell וחב' ב-International Journal of Molecular
Science משנת 2017).

שימוש במערכת של amplification refractory mutation לזיהוי של מוטציות hot spot (כגון מוטציות ב-KRAS, BRAF ו-EGFR) בנסיוב ובפלזמה עם
רגישות אנליטית בין 0.001% ל-2%, מאושרת לשימוש קליני (Mouliere וחב' ב-Translational Oncology משנת 2013 וכן ב-Molecular Oncology משנת 2014, Newton וחב' ב- Nucleic Acids Research משנת 1989, Spindler וחב' ב- Clinical Cancer
Research משנת 2012, Douillard וחב' ב- Clinical Cancer
Research ב -2014, Aung וחב' ב- Journal of Molecular Diagnosis משנת 2014, ו-Schreuer וחב' ב- Melanoma Research משנת 2016).
אף על פי כן, בדיקות שלdigital droplet PCR הן שטות כמותיות ומאוד
רגישות, המסוגלות לסרוק מולקולות-יעד בודדות ולהעשיר אללים מוטנטיים (Taly וחב' ב-Clinical Chemistry מ-2013, Oxnard וחב' ב-Clinical Cancer Research משנת 2014, Toro וחב' ב-Clinical Biochemistry משנת 2015, Baker ב-Nature Methods משנת 2012, Day וחב' ב- Methods משנת 2013, Chang וחב' ב-Molecular Oncology משנת 2016 ו-Shoda וחב' ב- Gastric Cancer משנת 2017). לכן, שיטות
אלו מתאימות באופן כללי לזיהוי של מוטציות hot spot בסרטן (Oshiro וחב' ב- Breast Cancer Research
& Treatment משנת 2015).

כאשר cfDNA משמש כחומר התחלתי,
אמפליפיקציות והֶשמטים (deletions) של ctDNA יכולים להתגלות על ידי whole exome sequencing או WGS, שיש לו היתרון שאין צורך בשום מידע ריצוף קודם (Chan וחב' ב- Proceedings of the National Academy of
Science USA משנת 2013, Lo וחב' ב-  Science Translational Medicineמשנת 2010, Murtaza וחב' ב-Nature משנת 2013, Jamal-Hanjani וחב' ב-Annals in Oncology משנת 2016 ו-Pereira וחב' ב- PLoS One משנת 2015. 

עיבוד אופטימאלי של הדם
לצורך אנליזה של cfDNA הפלזמה או הנסיוב חייבים להיות חסרי תאים לחלוטין, ולכן חיוני שהסרכוז הראשון של הדם יתבצע תוך זמן קצר ככל האפשר לאחר נטילת הדם להרחיק תאי דם שעלולים להתפרק ולהפריש DNA גנומי. הסרכוז השני מתבצע כדי להביא לריכוזים טובים יותר של cfDNA ולשפר את ניקיון הדגימה. 

הפרוטוקול האופטימאלי ממליץ על סרכוז ראשון למשך 10 דקות במהירות של 1,200g, וסרכוז שני למשך 10 דקות במהירות של 16,000 g (El Messaoudi וחב' ב-Clin Chim Acta משנת 2013, וב- Clin Cancer Res משנת 2016). 

מספר הקפדות נוספות שיש לתת עליהן את הדעת: 

1. אין להקפיא את דגימות הדם לפני מיצוי הפלזמה לצורך האנליזה של ctDNA

2. אם הדם נלקח במבחנת EDTA יש להקפיד על עיבוד הדגימה תוך 2–4 שעות

3. איסור להשתמש במבחנות הפארין שכן הפארין מעכב את תהליך ה-PCR על ידי שהוא מחקה את המבנה הסלילני של DNA

4. למרות ראיות לכאן ולאן, עדיין כדאי להעדיף דגימות פלזמה על דגימות נסיוב.

שיטות המיצוי של ctDNA
מגוון של שיטות אוטומטיות יכלו לשפר את ההדירות והיעילות של תהליך
המיצוי (Fong וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2009, ו-Malentacchi וחב' ב- Clin Chem Lab Med משנת 2015).
שיטות מיצוי קונבנציונאליות כגון פנול-כלורופורם, או שיטת salting-out בדרך כלל ממצות ריכוז גבוה יותר מאשר ערכות
מיצוי DNA מסחריות. עם זאת, אלו שיטות גוזלות זמן
ומורכבות.
מיצוי של cfDNA ניתן לביצוע בעזרת סינון
דרך עמודות-זיקה, המבוססות על חלקיקים מגנטיים או על פולימרים. יש מחקרים שהעדיפו
מיצוי על עמודת Qia gen's, בה הושגו 82-92% יעילות
מיצוי של cfDNA מהנסיוב, בעוד שאחרים
המליצו על עמודת Macherey-Nagel, מבחינת כמות ה-DNA שמוצה, דרגת הניקיון שלו והיעילות של קבלת
מקטעים קצרים של DNA. עם זאת, הערכה של Roche המבוססת על חלקיקים מגנטיים (MagNA Pure), הפיקה פי-2 עד פי-3 יותר DNA בהשוואה לעמודת Macherey-Nagel, ופי 5 עד פי-10 יותר DNA בהשוואה לעמודת Qiagen  על פי Jogez וחב' ב- Genetic Medicine משנת 2006).

 השפעה של תנאי אחסון הפלזמה ושל מספר מחזורים של הקפאה והפשרה
מספר מחקרים בחנו טמפרטורה אופטימאלית של אחסון הפלזמה לפני מיצוי
חומצת הגרעין, והשפעת הטמפרטורה על יציבות cfDNA. אחד המחקרים קבע שאחסון דגימת הפלזמה למשך שבועיים לא השפיעה על
רמות cfDNA בפלזמה, וכן שאיכות ושלמות cfDNA פחתו משמעותית לאחר 3 מחזורים של הקפאה
והפשרה (Chan וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2011). 

בגלל ההשפעה על ריכוזי ושלמות cfDNA, יש לפתח פרוטוקול
קדם-אנליטי אופטימאלי (Devonshire וחב' ב-Analytical Bioanalytical
Chemistry משנת 2014, Mauger וחב' באותו כתב עת משנת 2015 ו-Goldshtein וחב' ב- Ann Clinical Biochemistry משנת 2009).